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在临床前和临床研究中，LBA是用于定量剖析抗体生物药、抗药物抗体和可溶性卵白生物标记物浓度的主要要领之一。但由于研究样本主要由重大的生物基质组成，这些基质可能体现出一定的滋扰性，从而导致禁绝确的定量效果。本文将着重讨论在药物开发历程中怎样缓解或消除对LBA定量剖析要领滋扰的战略，重点关注抗体生物药的定量剖析。

由于篇幅有限，本文将接纳上下篇的形式来睁开叙述，敬请垂注！

抗体生物药在批准上市的生物药中占有很大的比例。

自1986年首次批准鼠抗体Muronomab-CD3上市，到2013年通过Glyco工程人源化的obinutuzumab上市以来，共36个抗体药物获批用于治疗人类疾病？⒖固逡┪锏囊桓鲋饕糠质瞧饰鲆┪锏囊ǘ荆┐ρ/（PK/TK），药效动力学（PD）和免疫原性（immunogenicity）表征。

动物研究中的PK和PD数据可用于PK/PD建模，并指导人体首次剂量的选择，随后可以启动PK/PD迭代建模和仿真（simulation）的历程，从而完善从早期到晚期的临床开发历程中的剂量选择？煽康腜K和PD数据是乐成地举行 PK/PD 建模和仿真的先决条件，生物药的免疫原性也能对其PK爆发很大的影响，是临床清静评估的主要组成部分。

别的，在临床研究中准确评估适当的生物标记物可以为靶标加入度、药理机制证实和原理证实以及选择最有可能对药物作出响应的患者群体提供有价值的信息。

免疫测试要领（Immunoassays）或更广义地称为配体团结式测试要领（ligand binding assays, LBA）是一种常用的剖析要领，用于测定抗体药物、抗药物抗体（ADA）和可溶性卵白生物标记物（soluble protein biomarkers）。这些测试针对的生物样本是重大的基质，包括种种因素，其可以显著地影响定量待测物的准确性。对剖析要领的滋扰（interference）之前在文献中讨论过，但关注的重点是临床化验室中所使用的化验要领，药物开发历程中使用的许多检测要领是定制开发的，对其表征也较少。

本文将着重于用于评估定量剖析抗体生物药浓度和ADA时遇到的滋扰以及缓解滋扰的战略。

要害术语

滋扰：测定值与现实钟别的征象。滋扰可能来自物质（substances）、测试程序、试剂和样本的收罗/处置惩罚。

相关文献中之条件出滋扰的界说是：样品中保存的物质，其施展影响或效应改变了对一个待测物的准确的剖析效果；该效果通常表达为待测物的浓度或活性数值。滋扰可以区分为依赖于待测物的和不依赖于待测物的两类。依赖于待测物的滋扰包括直接影响看待测物的检测（detection of the analyte）的所有因素。不依赖于待测物的滋扰能够在没有待测物的情形下爆发检测信号，或直接抑制测试试剂。滋扰导致效果的不真实可以是增添的或者镌汰的。

基质滋扰：导致测定的待测物浓度与其真实浓度差别的任何基质因素，引起基质滋扰的物质分子通常不得而知。

基质滋扰通常称为非特异性。一个测试要领是被设计用于检测（detect）某个特定的待测物，基质中任何能够爆发检测信号或者抑制待测物信号的组成因素都可以界说为非特异性滋扰。

然而，在对测试要领和待测物的生物学举行详细评估之后，通常所视察到的滋扰并不令人惊讶，并且是由一个确定的生物分子引起的。因此，生物剖析必需严酷地审阅现有的文献以及之前的研究效果和试剂的特异性，以便响应地确定该测试要领的特异性（specificity）。通常，滋扰（Interference）和特异性是相关的， 一个拥有绝对特异性的测试要领不应受到任何基质滋扰的影响。

可是，生物基质较为重大。即便对测试要领的系统和待测物的生物学有深度明确，也并不总是足以避免滋扰的爆发。与很少只检测到简单条带的western blots要领相似，大大都免疫测试要领（immunoassays）的特异性并不总是只针对一个待测物（图1举例说明晰差别类型的滋扰）。别的，滋扰物质的分子性子是未知的，镌汰滋扰最常用的要领是样本稀释。这种要领被普遍地使用，以致于大大都剖析科学家倾向于稀释所有的样本，而不信托未稀释样本的检测效果。

一类值得特殊注重的滋扰物质是样本中的抗体。Heterophilic抗体一样平常具有普遍的反应性、低亲和力、能交联（crosslink）捕获和检测抗体，容易导致过失的高信号效果。人抗动物抗体被以为具有较高的亲和力，由于许多测试试剂含有来自小鼠的单克隆抗体，因此，人抗小鼠抗体是特殊相关的一类滋扰物质。

当今临床上使用的测试要领仍然在某种水平上对heterophilic敏感，临床医生应该思量相关战略，以应对免疫测试得出的不准确效果所造成的潜在损害。类风湿因子（rheumatoid factor），即针对人类IgG的Fc区域的人类抗体，具有类似的效果，可以阻断待测物与试剂的团结或交联测试试剂，特殊是当试剂是人源的时间（例如，用抗体药物作为测试试剂举行ADA检测）。

滋扰也可以来自于待测物或测试试剂的转变甚至降解，从而导致检测信号的降低。当测试试剂可以团结到微孔板的外貌或其它测试平台上类似的外貌的时间，会不真实地增添测试信号。最后，当样本的收罗或处置惩罚历程引入了不反应所涉及生物体液中待测物浓度的特殊待测物时，待测物自己也就爆发滋扰（见图1）。同样，很是高浓度的待测物可以通过所谓的钩状效应抑制测试信号。

图1.免疫测试中的基质滋扰；HAMA：人抗鼠抗体; int.：滋扰分子; RF：类风湿因子

在支持临床前和临床研究的LBA要领中，可以在检测研究样本之前评估大大都的滋扰。这种评估和减轻滋扰的历程是定量剖析要领开发的一个主要组成部分，通？梢酝ü恍┘蚱拥氖笛槔凑瓜肿倘诺谋４。

平行性/线性和加标样品的接纳率

通？梢酝ü馐匝返囊涣∈屠凑瓜肿倘诺谋４。对差别水平的样本稀释，滋扰很可能会导致所测定的浓度（dilution-adjusted concentration）的转变或差别。在大大都测试中，这种并行性的缺乏通常在较高的稀释倍数下会消逝，批注滋扰是由一个基质组分引起的。因此，若是在高浓度的情形下泛起不平行性,滋扰很可能是由于高浓度的滋扰性基质因素，能够以高亲和力团结待测物或测试试剂的基质因素，或标准参考（比）物与内源性待测物之间的差别引起的。

严酷地说，后一种情形不是滋扰，而是批注标准参考（比）物不适适用于定量内源性待测物。在这种情形下，测试要领只是准（半）定量的。当一定量的待测物加入到样品中时，不受滋扰的剖析要领应该能够对加入量举行定量（接纳率=100% + 误差），基质滋扰往往会导致外加待测物的接纳率降低，即<100%。若是内源性待测物与添加的待测物的性子差别，如重组卵白vs内源性卵白，接纳率自己只能作为滋扰的一个指示。<>

阻断滋扰和特异性的相互作用

若是测试信号在添加阻断试剂（例如阻断缓冲液/ blocking buffers或heterophile阻断试剂）后爆发转变，则可能保存因测试试剂之间的相互作用或固体载体引起的基质滋扰。阻断试剂与稀释研究已被用于筛查滋扰的类型，使用特异性试剂阻断待测物可能会展现非特异性信号，由于特异性阻断试剂应该使得特异性信号的完全损失。若是测试信号或一部分信号在使用阻断试剂后仍然保存，这就意味着保存滋扰。

研究效果评估

纵然经由严谨的剖析要领开发，测试研究样本时也会泛起滋扰，有时是因抗体药物或联适用药导致的基质转变所引起的。泛起滋扰的指示是测试效果与给药后的预期效果纷歧致，特殊是在研究的历程中，较量个体的PK，PD和免疫原性数据时。相关的检测效果纷歧致也是保存滋扰的一个主要指示，然而关于研究效果是否有用的结论则应该审慎，出乎预料的效果很有可能也是有用的。

下一节将讨论在可溶性卵白生物标记物，抗体药物和ADA测试中视察到的滋扰。

可溶性卵白生物标记物的定量剖析已成为药物开发的基石，并为药物开发历程中的清静性、有用性、PD和作用机制的评估提供主要信息。血液循环或尿液中的可溶性卵白质样本很容易获得，在临床上作为通例的诊断性测试（diagnostic assays）使用，或用于展望患者对药物的反应。在这个领域中，诊断测试中保存滋扰是公认的，因此完全依赖某一个测试效果可能导致误诊。

一个显着的例子是在诊断性人绒毛膜促性腺激素检测（diagnostic human chorionic gonadotropin assay）中，最可能由heterophilic抗体滋扰引起的假阳性效果导致了不须要的，包括外科手术和化疗的治疗性干预。用于支持测试要领开发的研究的聚焦点（focus）和深度（depth），取决于该要领的预期目的，因而泛起“切合其用途（fit-for-purpose）的要领开发”这个术语。

关于生物标记物的剖析要领开发和验证，通用指南的宣布极大地推进了生物标记物检测的要领开发和验证的实践。本文关注的焦点在于测试要领对测试效果的滋扰。

样本收罗和处置惩罚

从血细胞中非特异性地释放待测物可能爆发在涉及血液基质的样品收罗或处置惩罚历程中，若是可溶性卵白生物标记物泛起这种情形，就会导致待测物浓度的假性升高以及测试效果的变异性增添。例如，在测定PDGF或VEGF等生长因子时，应注重选择最合适的样本类型，以阻止样本的处置惩罚历程非特异性地激活血小板并释放卵白质进入到样本中。关于这些待测物，血浆是比血清更合适的样本基质。

有研究批注，在剖析前样本的处置惩罚历程中，室温生涯会显著改变血液样本中IL-8的浓度。室温孵育会爆发更多的IL-8，导致血液裂解液（blood lysate）样本中IL-8的浓度不真实地增添。收罗后连忙将样品生涯在冰上，而不是室温下，可以镌汰这种影响。红细胞部分消融(溶血hemolysis)的血清或血浆样本并不少见，若是红细胞含有高浓度的待测物的话(例如，aspartate transaminase)，则会导致待测物的过失数值。

卵白质的构象可以影响检测试剂的检测能力，这可能由测试缓冲液中的因素引起。例如，血浆中钙的螯相助用已被证实会影响对钙团结卵白S100A12的检测。这样的滋扰可以通过使用不依赖于阳离子团结而能检测待测物的检测试剂，或在样本中加入阳离子，或选择不引起金属螯合的样本制备要领（例如肝素钠血浆或血清）来减轻。

在某些情形下，样本的物理特征会使移液变得难题，这种情形或将在测试历程中引入滋扰。例如，痰的粘度很高，以至于不可实现准确的移液。通过对通例的痰液接纳黏液消融剂dithiothreitol处置惩罚，可以降低总粘度；同时，还必需思量dithiothreitol的浓度及其对免疫测试试剂和待测物完整性的潜在影响。

别的，一些血浆或尿液样本中不溶性沉淀物引起的高污浊度会引入滋扰或高配景信号，可以通过离心或过滤来镌汰沉淀物，诸云云类的要领可以镌汰基质滋扰，并只管镌汰由机械性过失引起的误差。

特异性

如上所述，对剖析要领特异性的过失诠释是基质滋扰的主要缘故原由。一个可溶性卵白生物标记物可能有差别的高度同源的家族成员，异构体或前体卵白（precursor proteins）。若是一个结构上与现实待测物相关的卵白质，并且免疫剖析系统中的捕获试剂和检测试剂都能识别，那它就会导致可溶性卵白生物标记物泛起过失的高浓度效果（例如，一种商用的PDGF-BB测试要领也检测到10%的PDGF-AB）。

Periostin是嗜酸性气道炎症的生物标记物，具有多种亚型；在剖析要领的开发历程中，明确界说了该要领关于这些异构体的特异性。一些用于medullary thyroid carcinoma诊断的calcitonin剖析要领，似乎也部分检测到了pro-calcitonin，但后者关于medullary thyroid carcinoma没有诊断价值。

若是只有捕获试剂（或均相剖析中的检测试剂）与待测物相关的卵白质团结，则可能导致待测物的过失的低测定值？梢酝ü嘀す厣锵低忱疵魅泛椭卫碚庋淖倘。例如：确定潜在的交织反应因子及其相对浓度和亲和性、选择看待测物尽可能特异性的试剂、稀释样品（其可能将相关滋扰卵白的浓度降低到测试要领的检出限以下）。

另一种可能的要领是通过添加一种特定的试剂来消耗或中和系统中的滋扰异构体或家族成员卵白，这种试剂只压制（suppression）相关卵白，而不压制待测物自己。

团结卵白

可溶性受体或其它直接与待测物团结的卵白质的保存可能导致剖析信号的改变，由于它们可能在LBA测试中，阻断或增强与捕获或检测试剂的相互作用。例如，IL-6可与IL-6R和gp130形成复合物，可凭证检测试剂的差别，可以检测到差别性子的IL-6。通过选择测试试剂，其团结待测物，但不与样本中滋扰卵白竞争团结位点，则可以镌汰可溶性受体或团结卵白引起的滋扰，特殊是当引起滋扰的相互作用的亲和力低时，稀释可以镌汰滋扰。若是不可行，其他可能的要领涉及破损待测物和团结卵白或可溶性受体之间的团结。例如，酸解离可以从类胰岛素生长因子与其团结卵白的复合物中解离出类胰岛素生长因子，在中和样本之前加入团结卵白的抑制剂可以进一步镌汰滋扰。

对此类样本预处置惩罚，应严酷评估其对测试试剂或待测物表位的影响。由于此类基质滋扰可能难以完全消除，因此，最主要的是相识测试试剂的特异性以及检测到的待测物的种种复合物，以便据此诠释测试效果。

内源性抗体

如前所述，heterophilic抗体和抗动物抗体可以团结主要是动物泉源的抗体测试试剂；从而导致不真实的高或低效果。人抗小鼠抗体是最常见的人抗动物抗体类型，可以团结夹心式LBA要领中的捕获和/或检测试剂（取决于爆发试剂的物种）。与这两种试剂团结会导致试剂桥接和特定待测物的假阳性效果；与其中的一种团结，则可能会破损待测物的团结并导致假阴性效果。镌汰heterophilic抗体某人抗动物抗体滋扰的最常见要领是添加动物免疫球卵白（纯化或来自正常动物血清中的）或其他商用试剂（例如heterophile的阻断剂），这些试剂对heterophilic抗体具有特异的活性。

别的，对卵白质生物标记的抗体（自体抗体autoantibodies）可能导致过失的低或高信号。例如，针对thyroxine的自体抗体，保存于Hashimoto’s thyroiditis等疾病中，并在一个thyroxine竞争性免疫测试要领中与fluorescein-T4示踪剂团结，导致thyroxine测定值偏低。

均相的测定要领（homogenous assays）可能比sequential assays更容易受到这种滋扰。选择来自两个差别物种的试剂来捕获和检测待测物，也可能有助于镌汰人抗动物抗体的桥接滋扰。另一种要领是对样本举行足够的稀释以消除滋扰。使用G卵白去除滋扰抗体，或使用detergent破损嗜异性抗体的相互作用。这些和其它改变样本的处置惩罚可能会爆发问题，由于它们可能会意外地移除待测物或影响测试试剂。

其它样品因素

历史上，测定吸光度或光散射的临床测试要领受高脂(脂血症lipidemia)或胆红素(黄疸icterus)样本的影响，而LBA方规则不受影响。然而，胆红素降低了一个检测b型人绒毛膜促性腺激素和IgG的商业化的检测要领所测定的数值，滋扰可能来自预料之外的地方。

例如，胰腺囊肿液中的卵白酶可以降解待测物和试剂抗体，卵白酶也被嫌疑滋扰了痰标本中IL-5的检测，由于添加卵白酶抑制剂增添了IL-5的检测数值。有趣的是，在使用治疗剂量后，发明样本中的biotin对几个测试要领爆发了巨量滋扰。

游离和总体靶标剖析是针对可溶性抗原抗体药物最常用的靶标团结生物标记物。若是一个靶标的可溶性形式进入血液，或者膜团结靶标的可溶性异构体可能保存于血液循环中，则游离和总体靶标剖析数据也可作为针对膜抗原抗体的替换靶标团结生物标记物。

抗体药物对游离的靶标的压制（suppression）是权衡靶标团结效的直接体现。使用抗体药物治疗后，由于与抗体药物团结后靶标扫除率降低，总体靶标通常在血液循环系统中累积。由于靶标团结与其扫除率之间的这种关系，靶标总数间接地说明晰靶标的团结水平。别的，从总体靶标累积的数据，可以通过PK/PD模拟对游离靶标的压制。定量剖析游离和总体靶标，除了面临所有对可溶性卵白生物标记物的挑战外，还面临奇异的挑战。

要害术语

游离可溶性靶标的定量要领：权衡靶标加入度的测试要领。由于游离的药物和与药物靶标团结的药物之间的动态平衡在样本孵育历程中爆发转变，这种测定要领尤其受到检测程序自己的滋扰。

游离可溶性靶标的剖析要领

大大都测定游离可溶性靶点的要领都是基于捕获试剂与抗体药物竞争与靶点团结的原理。测试要领的特异性和对靶标生物学的明确是建设可靠的游离靶标剖析要领的要害。预期对这类要领的滋扰与先前讨论的生物标记物要领相同。别的，游离靶标的定量还会受到与要领的特异性，样本稀释，抗体药物/靶标复合物的无意解离、孵育时间和捕获试剂的浓度相关的滋扰。

对游离靶标的定量剖析中，靶标可能不但与抗体药物团结，并且还与内源的可溶性受体或团结卵白相互作用。在某些情形下，它们与靶标团结的亲和力与抗体药物相当。别的，靶标卵白的差别亚型纷歧定与抗体药物团结，因而纷歧定被被检测到。

确认一个要领能检测到的靶标组分（fraction of target）是至关主要的。它既可以是未团结抗体药物的组分（therapeutic antibody-unbound fraction），也可以是未团结抗体药物和团结卵白的组分（the binding protein- and therapeutic antibody-unbound fraction）。在这两种情形下，可能有须要在研究时代评估团结卵白水平的转变，以适外地诠释数据。别的，相识团结卵白是否抑制靶标卵白以及团结卵白是否与药物抗体竞争与靶标卵白的团结，也是至关主要的，由于一些靶标拥有多个团结卵白，因此应该将体外团结实验的重点放在对游离靶标效果有影响的团结卵白上。

许多LBA要领依赖稀释样原来镌汰未知泉源的基质滋扰。在游离靶标的剖析中，稀释样本改变了游离靶标与药物团结的靶标以及与血液循环中团结卵白或可溶性受体团结的靶标之间的动态平衡。此问题有两种解决计划：1.开发不需要稀释样本的剖析要领; 2.稀释样本并适外地报告效果。若是可行，始终优先思量在未稀释的样本中定量剖析游离的靶标。

在未稀释的样本中消除基质滋扰是一项难题的事情，由于生物基质是重大的，并且在血浆和血清中总卵白浓度很高。丈量未稀释样本的一种要领是使用与样本基质相似的缓冲液制备标准曲线，这将导致对标准曲线和样内情同的基质效应，因此测试效果不会受基质的影响。这个要领只有在单个样本之间的基质滋扰相对稳固的情形下才会有用，天生这种测试基质最准确的要领是将所有待测物消耗掉，并阻止depleting reagent进入样本基质。使用来自其它物种的血清或血浆（例如，胎牛血清）通常是足够的，由于它们不与捕获试剂团结，或者在均相剖析中也不与检测试剂团结。从操作的角度来看，未稀释的血清或血浆样品是粘稠的，在移液和稀释历程中需要格外小心，以确保测试的准确度和细密度。

从稀释的样本中准确地得出游离待测物的浓度也具有一定的可能性。在一个双组分系统中，抗体药物和亲和力与品貌是已知的，因此可以预估对稀释样本中待测物浓度的影响。关于平衡扰动对测定游离激素的影响有详细的研究。图2显示了一个简朴的、在差别的靶标/抗体药物比值下样本稀释的模拟。关于亲和力为0.1nM的典范抗体，靶标浓度为5 nM，关于靶标/抗体药物团结位点(CDR互补性确定区域)比例为1:3或更高的情形，未经稀释调解的浓度是相当准确的。关于CDR与靶标浓度比值较高的样本，较高的稀释度对未调解稀释的浓度（non-dilution-adjusted concentration）的影响不大。也可以通过模拟差别体内情形下的体外实验来验证数据报告的战略。关于在药物wash-out period竣事时网络的样本，即当抗体药物和靶标浓度趋于一致时，报告未稀释调解的数据将是禁绝确。在上面的例子中，当CDR与靶标的摩尔比值为1:1时，未经稀释调解的数据是禁绝确的。在相关研究中，必需界说一个客观标准，只在合适的时间点报告未经稀释调解的浓度数据。

图2. 在差别靶标-抗体浓度比值下，样本稀释对游离靶标的浓度的影响。假设：解离常数（KD）= 0.1 nM；样本中的待测物浓度为5 nM；抗体药物的CDR是1-，3-，10-，30-或100-倍于靶标的摩尔浓度

别的，测试试剂会引入一个误差，由于团结的和游离的靶标之间的动态平衡会爆发漂移（当保存特另外团结试剂，即捕获试剂的时间）。这种所谓的视察者效应（observer effect）诠释了一个物理原理：视察的行为会改变被视察的征象。

虽然这一原理与可溶性卵白生物标记物的定量剖析险些无关；然而，这一原理却很是适用于游离靶标的定量剖析，在总体靶标浓度高、游离靶标浓度低的样本中体现得尤其云云。在抗体药物给药后，由于与抗体团结后靶标的系统扫除率降低，总体靶标常在血液循环系统中累积。

对游离靶标最佳的定量剖析要领应该使用最少量的捕获试剂和较短的孵育时间，以最小化对平衡的滋扰。然而，这种要领降低了测试要领的细密度、稳健性和线性规模。因此，最好研究视察者效应的水平，并在游离靶标剖析的准确度和适用性之间找到一个平衡。

若是捕获试剂与抗体药物相同或很是相似，ADA就会滋扰游离靶标的定量。在这种情形下，ADA不但与抗体药物团结，并且还团结并阻断捕获试剂，因此很少或没有游离靶标能与捕获试剂团结，导致游离靶标的浓度大幅降低。这一效应可能导致纵然在没有抗体药物的情形下，靶标也被压制的假象，有鉴于此，应当阻止将抗体药物作为捕获试剂使用。

在药物开发早期，可能没有合适的试剂。若是抗体药物的免疫原性很是低，或者是单剂量给药的研究，在免疫系统最先爆发ADA之前抗体药物就被扫除了，则可以将抗体药物作为捕获试剂。亦可将ADA为阳性的小我私家的游离靶标数据扫除在最终的数据剖析之外。别的，在临床前研究中，可以从样本中剔除包括潜在的ADA在内的动物抗体。

可溶性靶标总量的剖析要领

抗体药物经常滋扰可溶性靶标总量的测定。纵然捕获和检测抗体的表位与抗体药物的表位都不重叠，仍然经；岱浩鹱倘？固逡┪锟赡芨谋浒斜甑墓瓜蠡蛴肓礁霭斜攴肿咏涣╟rosslink），导致靶标总量的高估或低估。为了规避这一效应，可以在样本中加入过量的抗体药物，将所有游离的可溶性靶标转化为药物-靶标复合物。添加过量的抗体药物后，就可以使用针对靶标-药物复合物的定量剖析系统来测定靶标总量。在这种情形下，ADA可能团结抗体药物造成滋扰，可通过形成多聚体复合物（multimeric complexes）来阻断检测（inhibit detection）或放大特定的检测信号。

Salimi-Moosavi等人证实，研究样本的碱性或酸性/guanidine 处置惩罚均可将抗体药物爆发不可逆变性，而靶标在样本中和后，则可恢复免疫反应性。这样的预处置惩罚能有用地消除抗体药物的所有滋扰（这种要领能普遍应用于其他卵白靶标和抗体药物，那将会很有意义）。

另一种要领是将仅使用一种非竞争性抗体和治疗性抗体作为试剂，使用非竞争性抗体捕获靶点游离或团结在治疗性抗体上。靶标和治疗性抗体,然后筛选了酸、中和和涂布到聚苯乙烯板上。进而用标记的治疗性抗体检测被包裹的靶点。

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